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有关于基因工程中的酶

导读:
在基因工程中提到不同种的酶,有限制性核酸内切酶,DNA酶,DNA连接酶,DNA聚合酶,RNA聚合酶,反转录酶,解旋酶等。现区分如下:
  DNA酶:是水解DNA的酶,将DNA分子水解为脱氧核苷酸。是切断相邻两个核苷酸之间磷酸二酯键的酶。
  DNA连接酶:是连接DN***?#27779;?#38388;的磷酸二酯键的酶。其在基因工程中的作用是把具有粘性末端的两个DN***段连接起来。
  DNA聚合酶:是连接DN***段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键的酶。主要在DNA的复制中起作用。
  DNA连接酶与DNA聚合酶间的区别:
  DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片?#25991;?#31471;的羟基上,形成磷酸二酯键;而DNA连接酶是在两个DN***?#27779;?#38388;催化形成磷酸二酯键。
  DNA聚合酶是以一条DNA为模板,将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链;而DNA连接酶是将DNA双链上的两个切口连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。
  可见,DNA酶、DNA连接酶、DNA聚合酶的共同之处是都作用于磷酸二酯键。
  DNA聚合酶主要连接DN***段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键,在DNA复制中起做用;DNA连接酶主要是连接DN***?#27779;?#38388;的磷酸二酯键,起连接作用.在基因工程中起作用,同时DNA连接酶在DNA复制中?#36130;?#20316;用,比如岗琦片段的连接!
  几种酶的比较:
  限制性核酸内切酶(以?#24405;?#31216;限制酶):限制酶主要存在于微生物(细菌、霉菌等)中。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,并且能在特定的切点上切割DNA分子。是特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶(“分子手术刀?#20445;?#21457;现于原核生物体内,现已分离出100多种,几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。例如,从大肠杆菌中发现的一种限制酶只能识别GAATTC序列,并在G和A之间将这段序列切开。目前已经发现了200多种限制酶,它们的切点各不相同。苏云金芽孢杆菌中的抗虫基因,就能被某种限制酶切割下来。在基因工程中起作用。
  DNA连接酶:主要是连接DN***?#27779;?#38388;的磷酸二酯键,起连接作用,在基因工程中起作用。 DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭DNA链上缺口酶,借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5’- PO4与另一DNA链的3’- OH生成磷酸二酯键。但这?#25945;?#38142;必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外),而且必须是?#25945;?#32039;邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。
  1 一般性质:大肠杆菌的DNA连接酶是一条分子量为75KD的多肽链。对胰蛋白酶敏感,可被其水解。水解后形成的小片段仍具有部份活性,可以催化酶与NAD(而不是ATP)反应形成酶- AMP中间物,但不能继续将AMP转移到DNA上推动磷酸二酯键的形成。DNA连接酶在大肠杆菌细胞中约有300个分子,和DNA聚合酶Ⅰ的分子数相近,这也是比较合理的现象。因为DNA连接酶的主要功能就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合,填满双链DNA上的单链间隙后封闭DNA双链上的缺口。这在DNA复制、修复和重组中起着重要的作用,连接酶有缺陷的突变株不能进行DNA复制、修复和重组。
  噬菌体T4DNA连接酶分子也是一条多肽链,分子量为60KD,其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所?#31181;啤?#27492;酶的催化过程需要ATP辅助。T4DNA连接酶可连接DNA- DNA,DNA- RNA,RNA- RNA和双链DNA粘性末端或平头末端。另外,NH4C1可以提高在大肠杆菌DNA连接酶的的催化速率,而对T4DNA连接酶则无效。无论是T4DNA连接酶,还是大肠杆菌DNA连接酶都不能催化?#25945;?#28216;离的DNA链相连接。
  2 作用机制:DNA连接酶利用NAD或ATP中的能量催化两个核酸链之间形成磷酸二酯键。反应过程可分三步:
  (1)NAD+或ATP将其腺苷酰基转移到DNA连接酶的一个?#34507;?#37240;残基的ε─氨基上形成共价的酶-腺苷酸中间物,同时?#22836;?#20986;?#26465;?#33018;单核苷酸(NMN)或焦磷酸。
  (2)将酶-腺苷酸中间物上的腺苷酰基再转移到DNA的5’-磷酸基端,形成一个焦磷酰衍生物,即DNA-腺苷酸;
  (3)这个被激活的5’-磷酰基端可以和DNA的3’- OH端反应合成磷酸二酯键,同时?#22836;?#20986;AMP。
  DNA连接酶所催化的整个过程是可逆的。酶-腺苷酸中间物可以与NMN或PPi反应生成NDA或ATP及游离酶;DNA-腺苷酸也可以和NMN及游离酶作用重新生成NAD。该逆反应过程可以在AMP存在的情况下使共价闭环超螺旋DNA被连接酶催化,产生有缺口的DNA-腺苷酸,生成松弛的闭环DNA。
  在真核生物细胞中也存在DNA连接酶,且有两型,分别称为连接酶Ⅰ和Ⅱ,反应中利用ATP所提供的能量。DNA连接酶Ⅰ分子量约为200KD,主要存在于生长旺盛细胞中,DNA连?#33521;?#20998;子量约85KD,主要存在于生长于不活跃的细胞中(resting cell)。
  DNA聚合酶:主要是连接DN***段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键,在DNA复制中起做用。
  DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上,形成磷酸二酯键;而DNA连接酶是在两个DN***?#27779;?#38388;形成磷酸二酯键,不是在单个核苷酸与DN***?#27779;?#38388;形成磷酸二酯键。
  DNA聚合酶是以一条DNA链为模板,将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链;而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。编辑本段]DNA聚合酶的发现
  在50年代的中期,A. Kornberg和他的同事们就想到DNA的复制必定是一种酶的催化作用,于是决心分离出这种酶并研?#31185;?#32467;构和作用机制。为了达到这个目的,他们分离的蛋白,然后加?#25945;?#22806;合?#19978;?#32479;中即同位素标记的dNTP、Mg2+及模板DNA,经过大量的工作,于1956年终于发现了DNA聚合酶Ⅰ(DNA polymerase Ⅰ,DNA pol Ⅰ)原来称为Kornberg酶。以后又相续发现了DNA pol Ⅱ和DNA pol Ⅲ。开始人们以为DNA pol I是细菌中DNA复制主要的酶类,后来发现DNA pol Ⅰ的突变株照样可以复制,才清楚它并不是主角。现在已经知道在DNA复制中起主导作用的是DNA pol Ⅲ,至于pol Ⅱ的功能现在还不十分清楚。DNA聚合酶的共同特点是:
  (1)需要基因工程中的酶论文资料由论文网http://www.mcxeh.tw提供,转载请保留地址.提供合成模板;(2)不能起始新的DNA链,必须要有引物提供3’-OH;(3)合成的?#36739;?#37117;是5’→3’(4)除聚合DNA外还有其它功能。
  所有原核和真核的DNA聚合酶都具有相同的合成活性,都可以在3’-OH上加核苷酸使链?#30001;歟?#20854;速率为1000 Nt/min。加什么核苷酸是根据和模板链上的碱基互补的原则而定的。
  E.coli的DNA pol Ⅰ涉及DNA损伤修复,在半保留复制中起辅助的作用。DNA pol Ⅱ在修复损伤中也是有重要的作用。DNA pol Ⅲ是一种多亚基的蛋白。在DNA新链的从头合成(de novo)中起复制酶的作用。
  RNA聚合酶(又称RNA复制酶、RNA合成酶)的催化活性:RNA聚合酶以完整的双链DNA为模板,转录时DNA的双链结?#20849;?#20998;解开,转录后DNA仍然保持双链的结构。真核生物RNA聚合酶:真核生物的转录机制要复杂得多,有三种细胞核内的RNA聚合酶:RNA聚合酶I转录rRNA,RNA聚合酶II转录mRNA,RNA聚合酶III转录tRNA和其它小分子RNA。在RNA复制和转录中起作用。
  反转录酶:RNA指导的DNA聚合酶,具有三种酶活性,即RNA指导的DNA聚合酶,RNA酶,DNA指导的DNA聚合酶。在分
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