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有關于基因工程中的酶

導讀:
在基因工程中提到不同種的酶,有限制性核酸內切酶,DNA酶,DNA連接酶,DNA聚合酶,RNA聚合酶,反轉錄酶,解旋酶等。現區分如下:
  DNA酶:是水解DNA的酶,將DNA分子水解為脫氧核苷酸。是切斷相鄰兩個核苷酸之間磷酸二酯鍵的酶。
  DNA連接酶:是連接DN***段之間的磷酸二酯鍵的酶。其在基因工程中的作用是把具有粘性末端的兩個DN***段連接起來。
  DNA聚合酶:是連接DN***段與單個脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵的酶。主要在DNA的復制中起作用。
  DNA連接酶與DNA聚合酶間的區別:
  DNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有的核酸片段末端的羥基上,形成磷酸二酯鍵;而DNA連接酶是在兩個DN***段之間催化形成磷酸二酯鍵。
  DNA聚合酶是以一條DNA為模板,將單個核苷酸通過磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補的DNA鏈;而DNA連接酶是將DNA雙鏈上的兩個切口連接起來。因此DNA連接酶不需要模板。
  可見,DNA酶、DNA連接酶、DNA聚合酶的共同之處是都作用于磷酸二酯鍵。
  DNA聚合酶主要連接DN***段與單個脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵,在DNA復制中起做用;DNA連接酶主要是連接DN***段之間的磷酸二酯鍵,起連接作用.在基因工程中起作用,同時DNA連接酶在DNA復制中也起作用,比如崗琦片段的連接!
  幾種酶的比較:
  限制性核酸內切酶(以下簡稱限制酶):限制酶主要存在于微生物(細菌、霉菌等)中。一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列,并且能在特定的切點上切割DNA分子。是特異性地切斷DNA鏈中磷酸二酯鍵的核酸酶(“分子手術刀”)。發現于原核生物體內,現已分離出100多種,幾乎所有的原核生物都含有這種酶。是重組DNA技術和基因診斷中重要的一類工具酶。例如,從大腸桿菌中發現的一種限制酶只能識別GAATTC序列,并在G和A之間將這段序列切開。目前已經發現了200多種限制酶,它們的切點各不相同。蘇云金芽孢桿菌中的抗蟲基因,就能被某種限制酶切割下來。在基因工程中起作用。
  DNA連接酶:主要是連接DN***段之間的磷酸二酯鍵,起連接作用,在基因工程中起作用。 DNA連接酶是1967年在三個實驗室同時發現的。它是一種封閉DNA鏈上缺口酶,借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA鏈的5’- PO4與另一DNA鏈的3’- OH生成磷酸二酯鍵。但這兩條鏈必須是與同一條互補鏈配對結合的(T4DNA連接酶除外),而且必須是兩條緊鄰DNA鏈才能被DNA連接酶催化成磷酸二酯鍵。
  1 一般性質:大腸桿菌的DNA連接酶是一條分子量為75KD的多肽鏈。對胰蛋白酶敏感,可被其水解。水解后形成的小片段仍具有部份活性,可以催化酶與NAD(而不是ATP)反應形成酶- AMP中間物,但不能繼續將AMP轉移到DNA上推動磷酸二酯鍵的形成。DNA連接酶在大腸桿菌細胞中約有300個分子,和DNA聚合酶Ⅰ的分子數相近,這也是比較合理的現象。因為DNA連接酶的主要功能就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合,填滿雙鏈DNA上的單鏈間隙后封閉DNA雙鏈上的缺口。這在DNA復制、修復和重組中起著重要的作用,連接酶有缺陷的突變株不能進行DNA復制、修復和重組。
  噬菌體T4DNA連接酶分子也是一條多肽鏈,分子量為60KD,其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。此酶的催化過程需要ATP輔助。T4DNA連接酶可連接DNA- DNA,DNA- RNA,RNA- RNA和雙鏈DNA粘性末端或平頭末端。另外,NH4C1可以提高在大腸桿菌DNA連接酶的的催化速率,而對T4DNA連接酶則無效。無論是T4DNA連接酶,還是大腸桿菌DNA連接酶都不能催化兩條游離的DNA鏈相連接。
  2 作用機制:DNA連接酶利用NAD或ATP中的能量催化兩個核酸鏈之間形成磷酸二酯鍵。反應過程可分三步:
  (1)NAD+或ATP將其腺苷酰基轉移到DNA連接酶的一個賴氨酸殘基的ε─氨基上形成共價的酶-腺苷酸中間物,同時釋放出煙酰胺單核苷酸(NMN)或焦磷酸。
  (2)將酶-腺苷酸中間物上的腺苷酰基再轉移到DNA的5’-磷酸基端,形成一個焦磷酰衍生物,即DNA-腺苷酸;
  (3)這個被激活的5’-磷酰基端可以和DNA的3’- OH端反應合成磷酸二酯鍵,同時釋放出AMP。
  DNA連接酶所催化的整個過程是可逆的。酶-腺苷酸中間物可以與NMN或PPi反應生成NDA或ATP及游離酶;DNA-腺苷酸也可以和NMN及游離酶作用重新生成NAD。該逆反應過程可以在AMP存在的情況下使共價閉環超螺旋DNA被連接酶催化,產生有缺口的DNA-腺苷酸,生成松弛的閉環DNA。
  在真核生物細胞中也存在DNA連接酶,且有兩型,分別稱為連接酶Ⅰ和Ⅱ,反應中利用ATP所提供的能量。DNA連接酶Ⅰ分子量約為200KD,主要存在于生長旺盛細胞中,DNA連接Ⅱ分子量約85KD,主要存在于生長于不活躍的細胞中(resting cell)。
  DNA聚合酶:主要是連接DN***段與單個脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵,在DNA復制中起做用。
  DNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羥基上,形成磷酸二酯鍵;而DNA連接酶是在兩個DN***段之間形成磷酸二酯鍵,不是在單個核苷酸與DN***段之間形成磷酸二酯鍵。
  DNA聚合酶是以一條DNA鏈為模板,將單個核苷酸通過磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補的DNA鏈;而DNA連接酶是將DNA雙鏈上的兩個缺口同時連接起來。因此DNA連接酶不需要模板。編輯本段]DNA聚合酶的發現
  在50年代的中期,A. Kornberg和他的同事們就想到DNA的復制必定是一種酶的催化作用,于是決心分離出這種酶并研究其結構和作用機制。為了達到這個目的,他們分離的蛋白,然后加到體外合成系統中即同位素標記的dNTP、Mg2+及模板DNA,經過大量的工作,于1956年終于發現了DNA聚合酶Ⅰ(DNA polymerase Ⅰ,DNA pol Ⅰ)原來稱為Kornberg酶。以后又相續發現了DNA pol Ⅱ和DNA pol Ⅲ。開始人們以為DNA pol I是細菌中DNA復制主要的酶類,后來發現DNA pol Ⅰ的突變株照樣可以復制,才清楚它并不是主角。現在已經知道在DNA復制中起主導作用的是DNA pol Ⅲ,至于pol Ⅱ的功能現在還不十分清楚。DNA聚合酶的共同特點是:
  (1)需要基因工程中的酶論文資料由論文網http://www.mcxeh.tw提供,轉載請保留地址.提供合成模板;(2)不能起始新的DNA鏈,必須要有引物提供3’-OH;(3)合成的方向都是5’→3’(4)除聚合DNA外還有其它功能。
  所有原核和真核的DNA聚合酶都具有相同的合成活性,都可以在3’-OH上加核苷酸使鏈延伸,其速率為1000 Nt/min。加什么核苷酸是根據和模板鏈上的堿基互補的原則而定的。
  E.coli的DNA pol Ⅰ涉及DNA損傷修復,在半保留復制中起輔助的作用。DNA pol Ⅱ在修復損傷中也是有重要的作用。DNA pol Ⅲ是一種多亞基的蛋白。在DNA新鏈的從頭合成(de novo)中起復制酶的作用。
  RNA聚合酶(又稱RNA復制酶、RNA合成酶)的催化活性:RNA聚合酶以完整的雙鏈DNA為模板,轉錄時DNA的雙鏈結構部分解開,轉錄后DNA仍然保持雙鏈的結構。真核生物RNA聚合酶:真核生物的轉錄機制要復雜得多,有三種細胞核內的RNA聚合酶:RNA聚合酶I轉錄rRNA,RNA聚合酶II轉錄mRNA,RNA聚合酶III轉錄tRNA和其它小分子RNA。在RNA復制和轉錄中起作用。
  反轉錄酶:RNA指導的DNA聚合酶,具有三種酶活性,即RNA指導的DNA聚合酶,RNA酶,DNA指導的DNA聚合酶。在分
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